Σύστημα μικρορευστοποίησης συν-καλλιέργειας για συναπτικά διαχωρισμένα νευρωνικά δίκτυα για διερεύνηση νευρωνικής παθολογίας που βασίζεται σε αστροκύτταρα

Ζώα

Όλη η χρήση ζώων εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Ζώων του Πανεπιστημίου της Τασμανίας (application21736) και διενεργήθηκε σύμφωνα με τον Αυστραλιανό Κώδικα Πρακτικής για τη Φροντίδα και τη Χρήση Ζώων για Επιστημονικούς Σκοπούς (2013). Οι αρουραίοι Sprague Dawley εκτράφηκαν από το Πανεπιστήμιο της Τασμανίας Animal Research Facility και στεγάστηκαν σε ξεχωριστά αεριζόμενα κλουβιά με κύκλο φωτός/σκότους 12 ωρών και ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. Νεογνικοί και εμβρυϊκοί αρουραίοι και των δύο φύλων χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή καλλιεργειών αστροκυττάρων και νευρώνων, αντίστοιχα.

Κατασκευή μικρορευστοποιητικής συσκευής συγκαλλιέργειας

Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα  1a–c, η προτεινόμενη πλατφόρμα συν-καλλιέργειας μικρορευστοποιημένων νευρώνων τριών διαμερισμάτων αποτελείται από δύο διαμερίσματα νευρώνων/αστροκυττάρων (αριστερά και δεξιά, 1,5 mm × 1,5mm-σύνδεση ανά μια τέχνη) διαμέρισμα (κάτω, 1,5 mm × 3,5 mm) μέσω δομών που μοιάζουν με λαβύρινθο. Αυτές οι δομές που μοιάζουν με λαβύρινθο έχουν σχεδιαστεί για να αναστέλλουν την ανάπτυξη των αξόνων και να αποτρέπουν τις συναπτικές συνδέσεις μεταξύ των δύο πληθυσμών νευρώνων, ενώ επιτρέπουν τη διείσδυση αστροκυττάρων σε όλα τα διαμερίσματα. Βασικό χαρακτηριστικό της συσκευής είναι η ικανότητα διατήρησης παρατεταμένων περιόδων υγρής απομόνωσης μεταξύ των διαμερισμάτων, η οποία επιτυγχάνεται μέσω 6 δεξαμενών υγρού (διαμέτρου 6 mm) που ρυθμίζουν την υδροστατική πίεση και τη ροή του υγρού.

Το εναλλακτικό κείμενο για αυτήν την εικόνα μπορεί να έχει δημιουργηθεί με χρήση AI.

ένα Σχηματική απεικόνιση νευρώνων και αστροκυττάρων που κατοικούν τη συσκευή μικρορευστοποίησης. Το αριστερό και το δεξί διαμέρισμα συν-καλλιέργειας συνδέονται με το διαμέρισμα μόνο για αστροκύτταρα μέσω μιας δομής που μοιάζει με λαβύρινθο. Ο όγκος στις δεξαμενές AC ελέγχει υδροστατικά τη ρευστή απομόνωση κάθε διαμερίσματος καλλιέργειας. σι Κλιμακωμένη σχηματική απεικόνιση της συσκευής μικρορευστοποιημένης κυτταροκαλλιέργειας, συμπεριλαμβανομένων λεπτομερών διαστάσεων. ντο Μικροσκοπική εικόνα της δομής που μοιάζει με λαβύρινθο με διαστάσεις. Κλίμακα bar = 250 µm. ρε Μια τρισδιάστατη οπτική προφιλομετρία της δομής που μοιάζει με λαβύρινθο, που περιλαμβάνει δέκα διαχωρισμένες τράπεζες με διαστάσεις 50 µm × 250 µm × 75 Aµm. Κλίμακα bar = 250 µm. μι Επίδειξη ρευστοποιημένης απομόνωσης με έγχρωμες βαφές στις δεξαμενές A1 (κόκκινο), A2 (πράσινο) και C1 και C2 (μπλε). Το ένθετο μεγεθύνει τα διαμερίσματα κυτταροκαλλιέργειας, εμφανίζοντας ρευστή απομόνωση του αριστερού (κόκκινη χρωστική) και του δεξιού (πράσινη χρωστική) διαμερισμάτων συνκαλλιέργειας που προκαλούνται από αυξημένη υδροστατική πίεση στο διαμέρισμα μόνο με αστροκύτταρα (μπλε βαφή). Κλίμακα bar = 3 mm; ένθετο 1,5 mm. φά Το αριστερό διαμέρισμα συν-καλλιέργειας γεμίστηκε με φθορίζον άλας νατρίου (FI) υπό ρευστή απομόνωση. Ο φθορισμός μετρήθηκε στην κόκκινη περιοχή ενδιαφέροντος (ROI) σε διάστημα 25 min. Κλίμακα bar = 750 µm. σολ Ένταση απορρόφησης του φθορισμού FI (au) σε ένα ROI του αριστερού διαμερίσματος συν-καλλιέργειας ποσοτικοποιημένο πάνω από 25 min. η Το διαμέρισμα μόνο για αστροκύτταρα γεμάτο με φθορίζον άλας νατρίου (FI) υπό ρευστή απομόνωση. Ο φθορισμός ποσοτικοποιήθηκε στην κόκκινη απόδοση επένδυσης (ROI) σε διάστημα 25-€‰min. Κλίμακα bar = 500 µm. εγώ Ποσοτικοποιημένες αλλαγές στην ένταση απορρόφησης φθορισμού FI (au) σε ένα ROI του κορυφαίου διαμερίσματος συν-καλλιέργειας σε διάστημα 25 min

Για την κατασκευή της συσκευής, δημιουργήθηκε ένα κύριο καλούπι σε ένα πολυ (μεθακρυλικό μεθυλεστέρα) (PMMA; RS components Pty Limited) υπόστρωμα (75 mm × 50 mm × 2 mm) χρησιμοποιώντας δύο στάδια φωτολιθογραφίας. Αρχικά, το PMMA επικαλύφθηκε λεπτά με ένα φωτοανθεκτικό στρώμα (SU-8 2005, Microchem), μαλακό ψήσιμο, υπερέκθεση και μετά το ψήσιμο για να σχηματιστεί η επιφάνεια κόλλας για το δεύτερο στρώμα. Η διαδικασία επαναλήφθηκε αμέσως με ένα παχύτερο στρώμα φωτοανθεκτικού (SU-8 3025, Microchem), που εκτέθηκε με μια μάσκα διαφάνειας υψηλής ανάλυσης και αναπτύχθηκε για να δημιουργήσει ένα δεύτερο στρώμα που αποτελείται από μια σειρά λαβύρινθων 10 όφθες τραπεζών (διαστάσεις: ύψος = 75 Âμm, πλάτος = 50 µm, μήκος = 250 Âμm, κανονικά διαστήματα = 50 Âμm στον άξονα Υ και απόσταση μεταξύ όχθεων = στο 15 διαμέρισμα μόνο για αστροκύτταρα (ύψος = 75 Âμm, πλάτος = 1,5 mm, μήκος = 3,5 mm) και δύο διαμερίσματα συν-καλλιέργειας (ύψος 7=5 πλάτος = 1,5 mm, μήκος = 1,5 mm). Το καλούπι ήταν μετα-ψημένο, αναπτυγμένο και σκληρό. Ο αναδιπλασιασμός της συσκευής διευκολύνθηκε με μαλακή λιθογραφία χρησιμοποιώντας έναν παράγοντα σκλήρυνσης προ-πολυμερούς, πολυ-διμεθυλσιλοξάνιο (PDMS) (μίγμα 10:1, Sylgard 184, Dow Corning, Inc), που ακολουθήθηκε από σκλήρυνση στους 70°‰°C όλη τη νύχτα. Μόλις αντιγραφούν, οι δεξαμενές για τα μέσα καλλιέργειας σχηματίστηκαν χρησιμοποιώντας μια διάτρηση βιοψίας (διάμετρος 6 ‰ mm, Kai Medical).

Προφιλομετρία επιφανειών

Οι μικρορευστές συσκευές PDMS που αναπαράγονται από το κύριο καλούπι εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο οπτικού προφίλ Wyko NT9100 (Veeco Instrument Inc.) για επαλήθευση των διαστάσεων του καναλιού και αξιολόγηση της πιστότητας των δομών που μοιάζουν με λαβύρινθο που σχηματίστηκαν κατά τη διαδικασία αναπαραγωγής. Η απεικόνιση οπτικού προφίλερ αναλύθηκε με χρήση οπτικού προφίλ διπλού φωτός LED στην παρεμβολομετρία κάθετης σάρωσης (VSI) με χρήση αντικειμενικού φακού 5°.

Προκαλλιέργεια συναρμολόγηση και προετοιμασία της συσκευής μικρορευστοποίησης

Οι μικρορευστικές συσκευές καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας κολλητική ταινία και πλύθηκαν σε 70% αιθανόλη όλη τη νύχτα πριν ακτινοβοληθούν με υπεριώδη ακτινοβολία για 30-€‰min. Οι συσκευές κολλήθηκαν μη αναστρέψιμα σε αποστειρωμένα γυάλινα καλύμματα (24 × 24 mm²Thermo Fisher Scientific) χρησιμοποιώντας μια φορητή μονάδα πλάσματος αέρα (Electro Technic Products Inc). Οι συνδεδεμένες συσκευές στη συνέχεια επικαλύφθηκαν με 0,001% πολυ-L-λυσίνη (PLL) σε ρυθμιστικό διάλυμα βορικού φωσφορικού άλατος 0,01 ‰M (PBS) για την προώθηση της προσκόλλησης των κυττάρων και επωάστηκαν (37ºC, 5% CO₂) για 24 h πριν από το πλύσιμο με αποστειρωμένο milli-Q^® και προσθήκη κατάλληλων μέσων κυτταροκαλλιέργειας.

Πριν από την επίστρωση των πρωτογενών νευρώνων του φλοιού, οι συσκευές γεμίστηκαν με μέσο ανάπτυξης νευρώνων (NGM) που περιείχε Neurobasal – συμπληρωμένο με 2% v/v B27, 0,5~mM glutamax, 25 ÂμM L-γλουταμινικό οξύ και 1% v/v πενικιλλίνη σε όλη την πενικιλίνη. αστροκύτταρα, οι συσκευές γεμίστηκαν με γλοιακά μέσα ανάπτυξης (GGM) που περιείχαν DMEM (Thermo Fisher Scientific) συμπληρωμένο με 10% v/v FBS και 1% πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη. NGM συμπληρωμένο με 10% v/v FCS (Thermo Fisher Scientific).

Επιβεβαίωση ρευστοποιημένης απομόνωσης

Η αποτελεσματικότητα της υγρής απομόνωσης μετρήθηκε έμμεσα με την παρατήρηση αλλαγών στην ένταση φθορισμού του άλατος νατρίου φλουορεσκεΐνης (FI) που φορτώθηκε στο αριστερό διαμέρισμα συνκαλλιέργειας. Το FI αραιώθηκε σε 1 mg/mL σε 0,01 M PBS και προστέθηκε στη δεξαμενή A1. Η ρευστή απομόνωση επιτεύχθηκε διατηρώντας τον όγκο υγρού και των δύο κορυφαίων φρεατίων (δεξαμενές Α1 και Α2) των διαμερισμάτων συνκαλλιέργειας σε χαμηλότερο επίπεδο (συνολικός όγκος 10 ΜL) από εκείνο του διαμερίσματος μόνο με αστροκύτταρα (δεξαμενές C1 και C2, 20  ενώ το μεσαίο διαμέρισμα1μL), ενώ παραμένει το μεσαίο διαμέρισμα1μL), άδειο. Το φθορίζον σήμα απεικονίστηκε σε διάστημα 25 º λεπτών χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού Nikon Eclipse TI-U, εξοπλισμένο με λογισμικό NIS-Elements BR 3.10 (Melville) και εξοπλισμένο με κάμερα υψηλής ευκρίνειας έγχρωμης συσκευής φόρτισης (CCD) (Nikon). Η απεικόνιση πραγματοποιήθηκε κάτω από έναν αντικειμενικό φακό 10° με έναν κύβο φίλτρου (Semrock, Rochester) που αποτελούνταν από ένα φίλτρο διέλευσης ζώνης διέγερσης (488 ± 10 nm), φίλτρο εκπομπής (520 ± 10 roic), mirror10 nm. Η περιοχή ενδιαφέροντος (ROI) ορίστηκε και οι αλλαγές στην ένταση φθορισμού (au) μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας FIJI (NIH). Για να ελέγξουμε τη ρευστή απομόνωση του διαμερίσματος μόνο για αστροκύτταρα, αντιστρέψαμε τη διαφορά υδροστατικής πίεσης προσθέτοντας 10 ÂμL στα διαμερίσματα συνκαλλιέργειας (δεξαμενές A1 και A2) και εισαγάγαμε τοπικό διάλυμα FI στις δεξαμενές C1 και C2. Στη συνέχεια απεικονίσαμε την αριστερή πλευρά του διαμερίσματος συν-καλλιέργειας και τη δομή που μοιάζει με λαβύρινθο μέσα στη συσκευή. Επιπλέον, αναλύσαμε επίσης την απορρόφηση φθορισμού του διαλύματος από κάθε διαμέρισμα χρησιμοποιώντας αυτόματο φθορόμετρο ανάγνωσης πλακών Fluostar Optima (BMG LABTECH), ρυθμισμένο σε διέγερση 460 nm και ανίχνευση εκπομπών 515 nm για FI μετά από 15 nm τοπική επεξεργασία AFI σε 1 λεπτό.

Συνκαλλιέργεια αστροκυττάρων και νευρώνων του φλοιού

Οι μικρορευστικές συσκευές μας ήταν γεμάτες με πρωτογενή αστροκύτταρα, νευρώνες του φλοιού ή συνκαλλιέργειες νευρώνων/αστροκυττάρων, σύμφωνα με το χρονοδιάγραμμα που περιγράφεται στο Σχ. S1. Για να ληφθούν καλλιέργειες αστροκυττάρων, πρωτογενή μικτά νευρογλοιακά κύτταρα παρασκευάστηκαν από τους φλοιούς των νεογνών αρουραίων 2-3 (P2-3) μεταγεννητικής ημέρας, όπως περιγράφηκε προηγουμένως¹⁴με μικρές τροποποιήσεις. Οι μήνιγγες αφαιρέθηκαν και ο φλοιώδης ιστός διαχωρίστηκε σε 0,0125% θρυψίνη στους 37°‰°C για 5°‰ λεπτά. Η θρυψίνη απενεργοποιήθηκε με GGM και ο ιστός διαχωρίστηκε μηχανικά. Το κυτταρικό εναιώρημα διηθήθηκε μέσω γάζας 70-μm και φυγοκεντρήθηκε (5-λεπτά, 300 rcf, θερμοκρασία δωματίου). Τα κυτταρικά σφαιρίδια διαχωρίστηκαν σε φρέσκο ​​GGM και επιστρώθηκαν σε φιάλες Τ75 προεπικαλυμμένες με 0,001% PLL σε PBS. Στις 7 έως 8 ημέρες, όταν επιτεύχθηκε η συρροή, η φιάλη ανακινήθηκε στις 200ºrpm, στους 37ºC, όλη τη νύχτα για να διαχωριστούν τα μη αστροκύτταρα από το στρώμα των αστροκυττάρων. Τα αποκολλημένα νευρογλοιακά κύτταρα αφαιρέθηκαν και τα αστροκύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας 0,05% Cells σε trys. Διαμερίσματα μόνο για αστροκύτταρα και συν-καλλιέργεια των μικρορευστοποιημένων συσκευών μέσω των δεξαμενών B1, B2, C1 και C2 σε πυκνότητα 5 × 10⁶ κύτταρα. Το GGM ανανεωνόταν κάθε 3 ημέρες.

Οι νευρώνες του φλοιού παρασκευάστηκαν από αρουραίους Sprague Dawley εμβρυϊκής ημέρας 18 (Ε18) όπως περιγράφηκε προηγουμένως¹⁵. Μετά την ανατομή, οι φλοιοί διαχωρίστηκαν σε 0,0125% θρυψίνη στους 37° για 5~ λεπτά, πλύθηκαν σε τροποποιημένο NGM και λειοτριβήθηκαν. Οι δεξαμενές C1 και C2 γεμίστηκαν με 20 ÂμL προθερμασμένου τροποποιημένου NGM. Φλοιώδεις νευρώνες (6 × 10⁶) αιωρήθηκαν σε 10 ÂμL τροποποιημένου NGM και στη συνέχεια σπάρθηκαν στα διαμερίσματα συνκαλλιέργειας μέσω των δεξαμενών Α1 και Α2. Διατηρώντας το επίπεδο των μέσων στο διαμέρισμα που περιέχει μόνο αστροκύτταρα υψηλότερο από τα άλλα διαμερίσματα, η υδροστατική πίεση εμπόδισε τους διασπασμένους νευρώνες να εισέλθουν με ρευστό τρόπο στον λαβύρινθο. Μετά τη σπορά, οι νευρώνες επωάστηκαν στους 37°C, 5% CO₂για 5 λεπτά για να επιτραπεί η συμμόρφωση_. Στη συνέχεια, όλα τα διαμερίσματα γεμίστηκαν αργά με προθερμασμένο τροποποιημένο NGM. Οι καλλιέργειες αναπτύχθηκαν στους 37 – ‰ ° C, 5% CO₂ και το τροποποιημένο NGM αντικαταστάθηκε 3 φορές την εβδομάδα.

Για την παρασκευή ρυθμισμένων μέσων καϊνικού οξέος (ΚΑ), οι πρωτογενείς φλοιώδεις νευρώνες καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω, με διαχωρισμένα κύτταρα επιστρωμένα σε πυκνότητα 3-10-κύτταρα ανά 12-mm στρογγυλή καλυπτρίδα. Οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37ºC με 5% CO¨ και το NGM αντικαταστάθηκε 3 φορές την εβδομάδα. Στις 7 ημέρες in vitro (DIV), 1-mM KA εφαρμόστηκε στις νευρωνικές μονοστιβάδες για 15-λεπτά στους 37-€‰°C, 5% CO. Οι μονοστοιβάδες στη συνέχεια πλύθηκαν με φρέσκο ​​NGM και επωάστηκαν για επιπλέον 6º ώρες υπό τις ίδιες συνθήκες. Τα προκύπτοντα ρυθμισμένα με ΚΑ μέσα συλλέχθηκαν και εφαρμόστηκαν σε συγκαλλιέργειες νευρώνων/αστροκυττάρων στις μικρορευστοποιητικές συσκευές για 15-€‰min.

Φαρμακολογικός χειρισμός

KA (1 mM, Sigma-Aldrich) ή ο διαπερατός από μεμβράνη χηλικός παράγοντας ασβεστίου BAPTA-AM (BA; 1 ÂμM; 1,2-δις-(2-αμινοφαινοξυ)αιθάνιο-N,N,N′,N′-τετραοξικό οξύ, etraacetoxym tetraacetic acid Ο έλεγχος φορέα διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO, Sigma) παρασκευάστηκε σε τροποποιημένο NGM και προθερμάνθηκε στους 37°‰°C πριν από την εφαρμογή. Μόνο θεραπεία ΚΑ εφαρμόστηκε στο αριστερό διαμέρισμα συν-καλλιέργειας στο 7 DIV. Η ρευστή απομόνωση του επεξεργασμένου αριστερού διαμερίσματος συν-καλλιέργειας επιτεύχθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. Το BA εφαρμόστηκε στο διαμέρισμα μόνο με αστροκύτταρα για 15-€‰λεπτά σε 7 DIV. Οι επεξεργασμένες καλλιέργειες διατηρήθηκαν υπό ρευστή απομόνωση σε τυπικές συνθήκες ανάπτυξης για 5 ή 15-€‰min, ακολουθούμενες από 3 πλύσεις με φρέσκο ​​τροποποιημένο NGM.

Προετοιμασία δείγματος πρωτεΐνης για φασματοφωτομετρία μάζας

Οι πρωτεΐνες συλλέχθηκαν από την αριστερή συγκαλλιέργεια, τη δεξιά συγκαλλιέργεια και τα διαμερίσματα μόνο με αστροκύτταρα των συσκευών σε 7 DIV συγκαλλιέργειας νευρώνων/αστροκυττάρων. Τα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές με ψυχρό PBS και στη συνέχεια λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που περιείχε ουρία (7-Μ, Sigma), θειουρία (2-Μ, Sigma), Tris-HCl (30-mM, Sigma), διθειοθρεϊτόλη (DTT, 10-M, Sigma-freease) αναστολείς (Roche). Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε υπερήχους σε πάγο για 3 κύκλους παλμών 15’s με διαστήματα 5’s. Τα κυτταρολύματα αναμίχθηκαν ήπια σε περιστροφικό αναμικτήρα εναιωρήματος στους 4°C για 16°‰h και φυγοκεντρήθηκαν στις 16.000°€‰σολ για 30€‰λεπτά. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε σε σωλήνες πρωτεΐνης LoBind (Eppendorf). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρωτεΐνης Pierce 660 nm (Thermo Fisher Scientific) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για κάθε δείγμα P, 20ºg πρωτεΐνης μειώθηκαν διαδοχικά κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4ºC χρησιμοποιώντας DTT (10ºmM, Sigma) και αλκυλίωση με ιωδοακεταμίδιο (IAA, 50ºmM, Sigma) για 2º σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι στο δωμάτιο. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε προετοιμασία δείγματος σε ένα δοχείο, ενισχυμένη σε στερεά φάση (SP3), ακολουθούμενη από πέψη με 1,2 μg πρωτεωμικής θρυψίνης/rLysC (Promega) κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 37ºC.

Φασματομετρία μάζας (MS)

Τα δείγματα πρωτεΐνης αναλύθηκαν με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης νανοροής – MS/MS χρησιμοποιώντας ένα νανοσύστημα Ultimate 3000 RSLC (Thermo Fisher Scientific) σε συνδυασμό με ένα φασματόμετρο μάζας Q-Exactive HF εφοδιασμένο με πηγή ιόντων νανοψεκασμού Flex (Thermo Fisher Scientific4 Burroximate) και ελεγχόμενο λογισμικό (App. Έγινε έγχυση 1 Âμg δείγματος και διαχωρίστηκε με χρήση τμηματοποιημένης διαβάθμισης 120 λεπτών με προσυγκέντρωση σε στήλη παγίδευσης PepMap 100 20 mm × 75 Âμm (3 Âμm διαχωρισμός C18 στη συνέχεια), Χρησιμοποιήθηκαν 250 mm × 75 µm στήλη PepMap 100 RSLC (2 µm C18) σε ταχύτητα ροής 300 nL/λεπτό και διατηρήθηκαν στα 35 °C για την παρακολούθηση δεδομένων του λογισμικού MS Tune (έκδοση). Τάση ψεκασμού 2,0 kV, επίπεδο RF φακού S 60 και θερμαινόμενο τριχοειδές ρυθμισμένο στους 250 °C φάσματα MS1 (390–1240 m/z) αποκτήθηκαν σε ανάλυση σάρωσης 120.000 με αυτόματο έλεγχο απολαβής προφίλ (AGC). 3 × 10⁶ και ακολουθούνται από διαδοχικές σαρώσεις MS2 σε 26 ανεξάρτητες απόκτησης δεδομένων (DIA) × 25 παράθυρα μονής μονάδας ατομικής μάζας (amu) στην περιοχή 397,5~1027,5 m/z, με 1 amu επικάλυψη 1 amu μεταξύ MS 2 διαδοχικής επικάλυψης ανάλυσης παραθύρων. 30.000 χρησιμοποιώντας στόχο AGC 1 × 10⁶μέγιστος χρόνος έγχυσης 55 ms και κανονικοποιημένη ενέργεια σύγκρουσης 27 eV.

Επεξεργασία και στατιστική ανάλυση ακατέργαστων δεδομένων MS

Τα ακατέργαστα αρχεία DIA MS υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας το λογισμικό Spectronaut (έκδοση 18, Biognosys AB). Μια ειδική για το έργο βιβλιοθήκη που περιλαμβάνει 6308 πρωτεϊνικές ομάδες δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας τη μηχανή αναζήτησης Pulsar για την αναζήτηση των φασμάτων DIA MS1 έναντι του Νορβηγικός αρουραίος (Rat)UniProt πρωτεόμιο αναφοράς UP000002494, συνενωμένο με κοινούς μολυσματικούς παράγοντες (που περιλαμβάνει 22.898 καταχωρήσεις, που λήφθηκαν τον Νοέμβριο του 2023). Με την εξαίρεση ότι αποκλείστηκαν οι πρωτεΐνες με ένα χτύπημα, χρησιμοποιήθηκαν προεπιλεγμένες ρυθμίσεις (εργοστάσιο Biognosys) τόσο για τη δημιουργία φασματικής βιβλιοθήκης όσο και για την εξαγωγή δεδομένων DIA. Για τη δημιουργία βιβλιοθήκης, αυτές περιελάμβαναν την αμινοτελική ακετυλίωση και την οξείδωση μεθειονίνης ως μεταβλητές τροποποιήσεις και την καρβαμιδομεθυλίωση κυστεΐνης ως σταθερή τροποποίηση, επιτρέπονταν έως και δύο χαμένες διασπάσεις και τα όρια αντιστοίχισης φάσματος πεπτιδίου, πρωτεΐνης και πεπτιδίου ορίστηκαν στο 0,01. Οι ανοχές μάζας βασίστηκαν στη βαθμονόμηση πρώτης διέλευσης και στην εκτεταμένη βαθμονόμηση, για τη βαθμονόμηση και τις κύριες αναζητήσεις, αντίστοιχα, με συντελεστές διόρθωσης ρυθμισμένους σε 1 στα επίπεδα MS1 και MS2. Η στοχευμένη αναζήτηση της βιβλιοθήκης με βάση την εξαγωγή ρεύματος ιόντων ανέπτυξε δυναμική ευθυγράμμιση χρόνου κατακράτησης με συντελεστή διόρθωσης 1.

Η ποσοτικοποίηση βασίστηκε στον αλγόριθμο MaxLFQ για την παραγωγή των αναλογιών πεπτιδίων μεταξύ της εκτέλεσης, ακολουθούμενη από κανονικοποίηση διασταυρούμενης εκτέλεσης με βάση τη διάμεση ένταση πεπτιδίου. Η διαφορική αφθονία πρωτεϊνών καλλιέργειας αστροκυττάρων/νευρώνων και καλλιέργειας μόνο αστροκυττάρων σε διαφορετικά διαμερίσματα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από δοκιμασία post hoc με μη ζευγαρωτά Student’s Two-tailed t-Δοκιμή με ρυθμό ψευδούς ανακάλυψης βάσει μετάθεσης που ορίζεται στο 0,05 και S0 = 0,1 για να αποκλειστούν πρωτεΐνες με πολύ μικρή διαφορά μεταξύ των μέσων (έκδοση λογισμικού Perseus 2.1.2.0, http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:start). Τα δίκτυα αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών αναγνωρίστηκαν χρησιμοποιώντας το STRING (έκδοση 12.0, http://www.string-db.org/). Προσδιορισμένες πρωτεΐνες που αυξήθηκαν σημαντικά ή μειώθηκαν σε αφθονία σε συν-καλλιέργειες νευρώνων/αστροκυττάρων σε σύγκριση με καλλιέργειες μόνο αστροκυττάρων σε διαφορετικά διαμερίσματα μεταφορτώθηκαν στο DAVID Bioinformatics Resource 6.8 (https://david.ncifcrf.gov/), για να ανακτηθεί το Reactome σχετικά με την οδό ανάλυσης μορίων και την κυτταρική λειτουργία εμπλουτισμού (GenGOe) διαμέρισμα και βιολογική διεργασία με Π < 0,05 μετά τη διόρθωση Benjaminiâ€"Hochberg θεωρήθηκαν σημαντικές. Τα πρωτεϊνικά δεδομένα φασματομετρίας μάζας έχουν κατατεθεί στην κοινοπραξία ProteomeXchange μέσω του PRIDE¹⁶ αποθετήριο συνεργάτη με το αναγνωριστικό δεδομένων PXD055523.

Ανοσοκυτταροχημεία και ομοεστιακή ανάλυση

Καλλιέργειες αστροκυττάρων μόνο νευρώνων ή νευρώνων σταθεροποιήθηκαν με 4% (w/v) παραφορμαλδεΰδη (Sigma) σε PBS για 30 ‰ λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και πλύθηκαν με 0,01 ‰M PBS. Τα σταθεροποιημένα κύτταρα διαπερατήθηκαν με 0,3% v/v για X0 0,3% ‰ 10 M 30-λεπτά πριν από τον αποκλεισμό σε 0,01-Μ PBS που περιέχει Triton X-100 (0,3% v/v, Sigma) και BSA (0,5% w/v, Sigma) για 30~min. καλλιέργειες μόνο νευρώνων και βIII τουμπουλίνη και GFAP (κουνέλι, Dako) για συνκαλλιέργειες αστροκυττάρων νευρώνων. Η αρχική επώαση αντισωμάτων διεξήχθη για 1º ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, ακολουθούμενη από ολονύκτια επώαση στους 4ºC. Μετά από πλύση 3 φορές με 0,01 Μ PBS για 10 λεπτά η καθεμία, οι καλλιέργειες επωάστηκαν με συζευγμένα με Alexa Fluor δευτερογενή αντισώματα (1:1000, Thermo Fisher Scientific) στο σκοτάδι για 2° ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα στη συνέχεια πλύθηκαν, τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες και αφέθηκαν να στεγνώσουν στον αέρα. Οι φθορίζουσες εικόνες καταγράφηκαν σε ένα όρθιο συνεστιακό μικροσκόπιο UltraVIEW Spinning Disk με αντικειμενικούς φακούς 20° και 40°, χρησιμοποιώντας το λογισμικό Velocity (PerkinElmer).

Για ποσοτική ανάλυση, η διείσδυση του άξονα μέσω των δομών που μοιάζουν με λαβύρινθο εκτιμήθηκε εκφράζοντας τον αριθμό των αξόνων μεταξύ κάθε τράπεζας ως ποσοστό του συνολικού αριθμού αξόνων μεταξύ των τραπεζών 1 και 2. Η μέση ένταση φθορισμού της σήμανσης GFAP μεταξύ κάθε όχθη του λαβυρίνθου μετρήθηκε από μία μόνο επίπεδη εικόνα. Για την αξιολόγηση της διεγερτοτοξικής παθολογίας, ελήφθησαν εικόνες από τουλάχιστον 3 τυχαίες θέσεις σε κάθε διαμέρισμα συνκαλλιέργειας. Τρεις ομοεστιακές εικόνες αναλύθηκαν από κάθε καλλιέργεια ως προβολές μέγιστης έντασης. Το ποσοστό των νευριτών με σφαιρίδια, που ορίζεται ως η εμφάνιση «σφαιριδίων σε κορδόνια» ή κιρσώδεις νευρίτες, βαθμολογήθηκε σε δύο ROI 50 µm × 50 Âμm που δημιουργήθηκαν σε κάθε εικόνα χρησιμοποιώντας το FIJI (NIH). Οι τιμές εκφράστηκαν ως ποσοστό των νευριτών με σφαιρίδια σε κάθε ROI.

Απεικόνιση ασβεστίου

Για να εκτιμηθεί η επίδραση των ΒΑ και ΚΑ στα επίπεδα αστροκυττάρου ασβεστίου, τα αστροκύτταρα στο διαμέρισμα μόνο για αστροκύτταρα φορτώθηκαν με το διαπερατό από τη μεμβράνη αντιδραστήριο ασβεστίου Fluo-4 direct. Το Fluo-4 προστέθηκε σε μέσα κυτταρικής καλλιέργειας και επωάστηκε για τουλάχιστον 1½ ώρα στους 37ºC, 5% CO₂ πριν από την απεικόνιση, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι εικόνες τραβήχτηκαν κάθε 2ºs για 2ºλεπτά χρησιμοποιώντας ένα μηχανοκίνητο ανεστραμμένο μικροσκόπιο Nikon Eclipse Ti2 (Nikon Instrument Inc, 20× στόχοι). Μετά από 1 λεπτό καταγραφής της γραμμής αναφοράς, KA (τελική συγκέντρωση 1 mM) εγχύθηκε (1:1000) στη δεξαμενή Α1 για την επεξεργασία των κυττάρων στο αριστερό διαμέρισμα συν-καλλιέργειας. Το BA εφαρμόστηκε στο διαμέρισμα μόνο με αστροκύτταρα (1:1000) μέσω των δεξαμενών C1 και C2 για να επιτευχθεί τελική συγκέντρωση 1 ΑμM. Για έλεγχο, το αντιδραστήριο Fluo-4 προστέθηκε σε καλλιέργειες απουσία φαρμακευτικής αγωγής. Πραγματοποιήθηκε απεικόνιση σύμφωνα με τις καλλιέργειες που υποβλήθηκαν σε αγωγή, με αντιπροσωπευτικές εικόνες και μετρήσεις που φαίνονται στα Σχ. S2a και b. Οι ROI σχεδιάστηκαν γύρω από μεμονωμένα σώματα αστροκυττάρων και οι αλλαγές στις εντάσεις φθορισμού αναλύθηκαν με FIJI (NIH). Τα γραφήματα που αντιπροσωπεύουν τη δυναμική του ασβεστίου υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον τύπο: (FF₀)/ΦΑ₀όπου το F ορίζεται ως η ένταση φθορισμού εντός ενός καθορισμένου ROI ενός κυττάρου τη φορά tκαι φά₀ είναι η βασική ένταση φθορισμού τη χρονική στιγμή t.

Στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές δοκιμές πραγματοποιήθηκαν στο Prism 8.0 (GraphPad). Τα δεδομένα προήλθαν από τουλάχιστον 3 ξεχωριστές επαναλήψεις καλλιέργειας. Όλα τα γραφικά δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος – τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM). Για σύγκριση μεταξύ ομάδων, χωρίς ζεύγη, με δύο ουρές t-χρησιμοποιήθηκαν τεστ, με ουδό σημαντικότητας των σελ < 0,05. Για συγκρίσεις που αφορούσαν περισσότερες από 2 ομάδες, πραγματοποιήθηκε μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από το post hoc τεστ Tukey, με σελ < 0,05 θεωρείται στατιστικά σημαντικό.