Ενισχύστε την αποτελεσματικότητα της καλλιέργειας iPSC με αυτοματοποιημένη διαφοροποιημένη ανίχνευση κυττάρων

Οι τεχνολογίες επαγόμενων πολυδύναμων βλαστοκυττάρων (iPSC) χρησιμοποιούνται συστηματικά στη μοντελοποίηση ιστών και στην ανάπτυξη μιας σειράς τύπων ανθρώπινων κυττάρων. Είναι δυνατό να ληφθούν iPSC από άτομα που φέρουν γενετικές μεταλλάξεις που σχετίζονται με ασθένειες και γενετικές μεταλλάξεις μπορούν επίσης να εισαχθούν μέσω της χρήσης τεχνολογιών CRISPR.

Η μη αυτόματη καλλιέργεια και η μεταφορά iPSC απαιτεί ένταση εργασίας, αλλά αυτή η διαδικασία μπορεί να αυτοματοποιηθεί χρησιμοποιώντας το CellXpress.ai^® Αυτοματοποιημένο Σύστημα Κυτταρικής Καλλιέργειας. Αυτό το σύστημα αυτοματοποιεί τη διαδικασία διέλευσης κυττάρων από την αρχική σπορά έως τη διέλευση, γεγονός που διευκολύνει την αυτοματοποιημένη επίστρωση των iPSC, τις ανταλλαγές μέσων και την περιοδική παρακολούθηση μέσω απεικόνισης.

Το όργανο περιλαμβάνει μια ενσωματωμένη συσκευή απεικόνισης, έναν χειριστή υγρών, μια αυτοματοποιημένη θερμοκοιτίδα και λογισμικό προγραμματισμού και ανάλυσης, που επιτρέπει τον έλεγχο της διαδικασίας που βασίζεται στην απεικόνιση και την ανάλυση εικόνας.

Το σύστημα CellXpress.ai προσφέρει μια σειρά από πλεονεκτήματα, όπως:

• Βελτιωμένη απόδοση: Η αυτοματοποιημένη καλλιέργεια iPSC με δυνατότητα μηχανικής μάθησης μειώνει σημαντικά την προσπάθεια και τον χρόνο που απαιτείται για τις διαδικασίες κυτταροκαλλιέργειας, πράγμα που σημαίνει ότι οι επιστήμονες μπορούν να επικεντρωθούν σε πιο σημαντικές εργασίες ενώ επιταχύνουν τα χρονοδιαγράμματα έρευνας και ανάπτυξης.
• Επεκτασιμότητα και ευελιξία: Η μέθοδος επιτρέπει την κλιμάκωση της έρευνας αυξάνοντας τον αριθμό των πλακών και των δειγμάτων.
• Βελτιωμένη συνέπεια: Οι προηγμένοι αλγόριθμοι μηχανικής μάθησης διασφαλίζουν την ακριβή ανίχνευση αποικιών βλαστοκυττάρων και την ακριβή διαφοροποίηση των iPSC. Αυτή η προσέγγιση είναι το κλειδί για την ελαχιστοποίηση του ανθρώπινου λάθους και τη βελτίωση της αξιοπιστίας των πειραματικών αποτελεσμάτων.
• Εξοικονόμηση κόστους: Οι αυτοματοποιημένες διαδικασίες καλλιέργειας iPSC έχουν ως αποτέλεσμα μειωμένο κόστος εργασίας και αποτελεσματικότερη χρήση των πόρων.

Το σύστημα CellXpress.ai προσφέρει ισχυρή λειτουργία χειρισμού υγρών που έχει σχεδιαστεί για να επιτρέπει την ανταλλαγή μέσων και τα πρωτόκολλα διέλευσης κυττάρων, παράλληλα με δυνατότητες απεικόνισης που έχουν σχεδιαστεί για την περιοδική παρακολούθηση της κυτταρικής καλλιέργειας.

Η ανάλυση εικόνας, με ενσωματωμένες δυνατότητες μηχανικής μάθησης, είναι σε θέση να αναγνωρίσει αποικίες iPSC και διαφοροποιημένες περιοχές. Μπορεί επίσης να λάβει αποφάσεις σχετικά με τα επερχόμενα βήματα της διαδικασίας, όπως να προχωρήσει στη διέλευση του iPSC ή να αγνοήσει τα φρεάτια για να εξοικονομήσει χρόνο και μέσα κυτταρικής καλλιέργειας (για παράδειγμα, σε περίπτωση εμφάνισης διαφοροποιημένων κυττάρων). Εναλλακτικά, το σύστημα μπορεί απλώς να ζητήσει από τον χρήστη να κάνει check in στο πείραμα.

Αυτό το άρθρο περιγράφει μια μέθοδο που έχει σχεδιαστεί για την αυτοματοποίηση της κουλτούρας iPSC που υποστηρίζεται από μηχανική μάθηση. Τα πρωτόκολλα του συστήματος CellXpress.ai χρησιμοποιούνται για την αυτόματη ενεργοποίηση της διέλευσης κυττάρων σύμφωνα με τις τιμές που καθορίζονται από τον χρήστη για τη συρροή των αποικιών βλαστοκυττάρων.

Ένα πρωτόκολλο δευτερεύουσας ανάλυσης χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό περιοχών διαφοροποιημένων κυττάρων, επιτρέποντας είτε την ειδοποίηση του χρήστη είτε τον αυτόματο αποκλεισμό φρεατίων που περιέχουν αυτά τα κύτταρα. Αυτή η προσέγγιση προσφέρει στους ερευνητές μια απομακρυσμένη λύση για την καλλιέργεια iPSC.

Μέθοδοι

Αυτοματοποιημένη κουλτούρα iPSC

Η καλλιέργεια iPSC ATCC 201B7 (ATCC-ACS-1023) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό μέσων mTeSR Plus (Κατάλογος # 100-1130) και μια βασική ροή εργασίας από τη STEMCELL Technologies (Βανκούβερ, Καναδάς).^1,2

Μια μέθοδος διέλευσης συστάδων με αντιδραστήριο ReLeSR (ReLeSR, STEMCELL Technologies, Cat. # 100-0484) χρησιμοποιήθηκε για τη διέλευση κυττάρων.

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων επικαλυμμένων με βιτρονεκτίνη 12 (Vitronectin XF, STEMCELL Technologies, Catalog # 100-0763), με την επικάλυψη να εκτελείται σε τελική συγκέντρωση 10 μg/mL τουλάχιστον μία ώρα πριν από τη διέλευση, επιτρέποντας αποθήκευση στους 4 °C πριν από τη διέλευση για έως και μία εβδομάδα.

Οι κυτταρικές πλάκες παρακολουθούνταν περιοδικά με απεικόνιση τους κάθε 23 ώρες, με ανταλλαγές μέσων που πραγματοποιούνταν κάθε 24 ώρες. Τα κύτταρα διήλθαν σε περίπου 70% συρροή, γενικά πέντε ημέρες μετά τη σπορά.

Ανάλυση εικόνας

Η ανάλυση εικόνας χρησιμοποίησε ένα πρωτόκολλο που βασίζεται στη μηχανική μάθηση που περιλαμβάνεται στο λογισμικό συστήματος CellXpress.ai. Αυτό το πρωτόκολλο είχε εκπαιδευτεί εκ των προτέρων ώστε να αναγνωρίζει αδιαφοροποίητες αποικίες iPSC.

Ένα δεύτερο πρωτόκολλο ανάλυσης είχε προεκπαιδευτεί για να αναγνωρίζει συγκεκριμένα περιοχές διαφοροποιημένων κυττάρων, επειδή αυτές οι περιοχές αντιπροσωπεύουν ένα ανεπιθύμητο συμβάν κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας iPSC.

Οι κανόνες λήψης αποφάσεων ορίστηκαν στο πρωτόκολλο με βάση την ανάλυση εικόνας, επιτρέποντας τόσο την αυτοματοποιημένη διέλευση καλλιέργειας iPSC όσο και τον αποκλεισμό φρεατίων που εμφανίζουν διαφοροποίηση.

Κυτταρική χρώση για τον χαρακτηρισμό των iPSC

Τα iPSC σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων και αναπτύχθηκαν σε συρροή μετά το τρίτο πέρασμα στο σύστημα CellXpress.ai. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 1 mL μονιμοποιητικού διαλύματος (4 % φορμαλδεΰδη σε DPBS, Αρ. Κατ. Α24344) για συνολικά 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.

Ακολούθησε διαπερατότητα με 1 mL Διαλύματος Διαπερατότητας S (1 % σαπωνίνη σε DPBS, Αρ. Κατ. Α24878) για συνολικά 15 λεπτά.

Η δέσμευση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 1 mL Διαλύματος Αποκλεισμού (3 % BSA σε DPBS, Αρ. Κατ. Α24353) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.

Τα κύτταρα επωάστηκαν με πρωτογενή αντισώματα αραιωμένα σε Διάλυμα Αποκλεισμού. Αυτό διεξήχθη χρησιμοποιώντας 5 μL αντι-SSEA4 (IgG3 ποντικού, Αρ. Κατ. Α24866) και 2,5 μL αντι-OCT4 (κουνέλι, Αρ. Κατ. Α24867) σε συνολικό όγκο 1 mL για τρεις ώρες στους 4°C.

Τα κύτταρα επωάστηκαν με 2 μL Alexa Fluor^â„¢ 488 κατσικίσιο αντι-ποντικίσιο IgG3 και 2 μL Alexa Fluor^â„¢ 555 γαϊδουριού αντικουνελιού σε 1 mL Αποφρακτικό Διάλυμα για συνολικά μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Αυτό διεξήχθη μετά από τρεις πλύσεις με 1 mL ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης 1Χ (Κατ. Αρ. Α24348).

NucBlue^â„¢ DAPI (Κατ. Αρ. R37606) προστέθηκε κατά τη διάρκεια της τελικής πλύσης και στη συνέχεια επωάστηκε για πέντε λεπτά. Όλα τα αντιδραστήρια χρώσης είναι της Thermo Fisher Scientific. Το σύστημα CellXpress.ai χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση απεικόνισης σε μεγέθυνση 10Χ.

Αποτελέσματα

Αυτοματοποιημένη μέθοδος καλλιέργειας και διέλευσης iPSC

Το αυτοματοποιημένο πρωτόκολλο για την καλλιέργεια και τη διέλευση iPSC έγινε σύμφωνα με τα προηγούμενα πρωτόκολλα, με αυτό το πλήρως αυτοματοποιημένο πρωτόκολλο να περιλαμβάνει επίσης την αυτοματοποιημένη διέλευση και επέκταση των iPSC.

Το πρωτόκολλο βασίστηκε στην προκαθορισμένη φάση «Σίτιση με διέλευση», συμπεριλαμβανομένων περιοδικών ανταλλαγών μέσων και απεικόνισης (Εικόνα 1Α και Εικόνα 1Β). Οι ανταλλαγές μέσων περιελάμβαναν ολική απομάκρυνση των μέσων από φρεάτια και πλύση με PBS, ακολουθούμενη από την εκ νέου προσθήκη 2 mL μέσου σε κάθε μεμονωμένο φρεάτιο.

Οι ανταλλαγές μέσων πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ζεύγος άκρων πιπέτας του 1 ml, μετά την αφαίρεση του καπακιού και την κλίση της πλάκας στο κατάστρωμα χειρισμού υγρών. Η απεικόνιση της καλλιέργειας iPSC ολοκληρώθηκε σε μεγέθυνση 4Χ, με 6Χ6 θέσεις ανά φρεάτιο. Η ανάλυση εικόνας έγινε εν κινήσει χρησιμοποιώντας προκαθορισμένα πρωτόκολλα.

Τα βήματα μετάβασης δεν ορίζονται περιοδικά, αλλά μπορούν να ενεργοποιηθούν ενεργά με το λογισμικό συστήματος CellXpress.ai από τον χρήστη ή να ενεργοποιηθούν αυτόματα με βάση την ανάλυση εικόνας.

Η διέλευση περιλαμβάνει τα ακόλουθα βήματα:

1. Προετοιμασία των πινακίδων προορισμού: Οι πλάκες με επίστρωση πρέπει να μετακινούνται από την περιοχή αναλώσιμων στο κατάστρωμα στην περιοχή εργασίας. Το διάλυμα προεπικάλυψης πρέπει να αφαιρεθεί πριν προστεθούν φρέσκα μέσα στις νέες πλάκες. Οι πλάκες στη συνέχεια θα μετακινηθούν στον επωαστήρα πριν από τη σπορά.
2. Επεξεργασία των αρχικών πλακών: Οι πλάκες που περιέχουν iPSC μετακινούνται από τον επωαστήρα στην περιοχή του καταστρώματος. Αυτές οι πλάκες στη συνέχεια υποβάλλονται σε επεξεργασία με προθερμασμένο αντιδραστήριο ReLeSR πριν από την προσθήκη μέσων, επαναιωρώντας τα κύτταρα μέσω επαναλαμβανόμενης πιπέτας.
3. Σπορά κυττάρων: Οι πλάκες προορισμού στη συνέχεια μετακινούνται στην περιοχή του καταστρώματος. Το κυτταρικό εναιώρημα που παρασκευάζεται στο βήμα 2 κατανέμεται στις πλάκες που παρασκευάζονται στο στάδιο 1 σε όγκους κυττάρων που καθορίζονται από τον χρήστη. Το εναιώρημα κυττάρων κατανέμεται σε έναν αριθμό θέσεων κατά μήκος του φρεατίου για να διασφαλιστεί μια πιο ομοιόμορφη κατανομή των κυττάρων.

Στη συνέχεια, οι πλάκες μεταφέρονται σε ολόκληρο το κατάστρωμα χειρισμού υγρών με μια κίνηση σχεδιασμένη να εξασφαλίζει ομοιόμορφη ανάμειξη και στη συνέχεια μεταφέρονται στον επωαστήρα. Οι βασικές παράμετροι χρήστη μπορούν να βελτιστοποιηθούν για να διασφαλιστεί η βέλτιστη απόδοση και απόδοση, συμπεριλαμβανομένων των ρυθμών ροής υγρού, των όγκων πιπέτας, της απόστασης διανομής πιπέτας στον πυθμένα του φρέατος και των βημάτων ανάμειξης και διανομής.

Ανίχνευση αποικιών βλαστοκυττάρων και συρροής μέσω ανάλυσης εικόνας και ενεργοποίησης αυτοματοποιημένης διέλευσης iPSC

Οι μη αυτόματες εκτιμήσεις της συρροής ή της διαφοροποίησης του iPSC είναι συνήθως υποκειμενικές και επιρρεπείς σε διακυμάνσεις μεταξύ των χρηστών, αλλά η αυτοματοποιημένη απεικόνιση και ανάλυση μπορεί να μειώσει αυτή τη μεταβλητότητα παρέχοντας μια πιο αντικειμενική αξιολόγηση.

Η ανάλυση εικόνας στο παρουσιαζόμενο παράδειγμα χρησιμοποίησε ένα πρωτόκολλο βασισμένο σε μηχανική μάθηση, το οποίο είχε προεκπαιδευτεί για να αναγνωρίζει αδιαφοροποίητες αποικίες iPSC.

Το πρωτόκολλο ανάλυσης πρόσφερε μια σειρά από ενδείξεις, συμπεριλαμβανομένων μετρήσεων υφής, έντασης, εμβαδών και ομοιομορφίας περιοχής, συμπεριλαμβανομένης της συμβολής των αποικιών iPSC που δυνητικά κυμαίνονταν μεταξύ 0 και 1 (που αντιστοιχεί σε 0 έως 100 % συρροή).

Μια τιμή 0,7 (70 % συρροή) χρησιμοποιήθηκε αρχικά ως έναυσμα για την αυτοματοποιημένη διέλευση των κυττάρων iPSC κατά τη συντήρηση ή την επέκταση του iPSC. Κατά τη βελτιστοποίηση της ανάλυσης, ωστόσο, καθορίστηκε ότι το 0,6 ήταν μια πιο βέλτιστη τιμή για τα πρωτόκολλα μακροπρόθεσμης διέλευσης.

Εικόνα 1. Α. Στιγμιότυπο οθόνης λογισμικού του αυτοματοποιημένου πρωτοκόλλου καλλιέργειας iPSC που περιλαμβάνει βήματα Τροφοδοσία, Απεικόνιση, Ανάλυση (με λήψη αποφάσεων) και Μετάβαση. B. Εικόνα του βήματος ανταλλαγής μέσων που επισημαίνει την κλίση της πλάκας στο πάτωμα χειρισμού υγρών του οργάνου. Γ. Λεπτομερή βήματα για την επεξεργασία πλακών iPSCÂ. Δ. Παράδειγμα βημάτων μικρορύθμισης για βελτιστοποίηση του πρωτοκόλλου. Πίστωση εικόνας: Molecular Devices UK Ltd

Αποικίες βλαστοκυττάρων και μάσκες ανάλυσης χρησιμοποιήθηκαν για τον εντοπισμό περιοχών βλαστοκυττάρων (Εικόνα 2Α). Ο κανόνας απόφασης του πρωτοκόλλου βασιζόταν στη συρροή βλαστοκυττάρων, με έναν κανόνα «ανά φρεάτιο» που εφαρμόστηκε για τον εντοπισμό και την ειδοποίηση του χρήστη όταν τα μεμονωμένα φρεάτια είχαν φτάσει σε ένα καθορισμένο όριο.

Οι ειδοποιήσεις στάλθηκαν στον χρήστη όταν οι αποικίες iPSC (StemCellPatches) σε μια καλή συρροή έφτασαν το 70%, προτρέποντας τη μη αυτόματη αναθεώρηση των αποτελεσμάτων και επιτρέποντας στον χρήστη να αποφασίσει εάν θα ξεκινήσει τη διέλευση κελιών. Ήταν επίσης δυνατή η αυτόματη ενεργοποίηση της διέλευσης κυψέλης, χωρίς την είσοδο του χρήστη (Εικόνα 2Β).

Ο κανόνας “ανά πιάτο” χρησιμοποιήθηκε για την αυτόματη ενεργοποίηση της διέλευσης βάσει των αποτελεσμάτων απεικόνισης. Η διέλευση ενεργοποιήθηκε μόλις το 70 % των φρεατίων σε μια πλάκα έφθασε στην επιθυμητή συρροή, επιτρέποντας την πλήρως αυτοματοποιημένη διαχείριση καλλιέργειας iPSC (Εικόνα 2D).

Είναι επίσης δυνατή η προσαρμογή των κανόνων απόφασης και των ορίων ενεργοποίησης κατά τη διάρκεια του πειράματος. Για παράδειγμα, οι χρήστες μπορούν είτε να ενεργοποιήσουν τη μετάβαση με μη αυτόματο τρόπο είτε να μειώσουν το όριο εάν δεν ενεργοποιηθεί η διέλευση επειδή το όριο έχει οριστεί πολύ ψηλά. Για παράδειγμα, το αρχικό όριο συρροής 0,7 μειώθηκε αργότερα σε 0,6 μετά από οπτική ανασκόπηση εικόνων καλλιέργειας (Εικόνα 2C).

Εικόνα 2. Α. Εικόνες αποικιών iPSC με μάσκες ανάλυσης εικόνας που αναγνωρίζουν περιοχές βλαστοκυττάρων (σε ροζ). Β. Κανόνας λήψης αποφάσεων που ορίζει μια απόφαση ανά φρεάτιο για ειδοποίηση του χρήστη όταν η συρροή σε ένα μεμονωμένο φρεάτιο φτάσει το 70 % (0,7). Γ. Κανόνας λήψης αποφάσεων που ορίζει μια απόφαση ανά πλάκα για ειδοποίηση του χρήστη και συνέχιση της διέλευσης όταν το 70 % των φρεατίων φτάσει στο όριο συρροής. Δ. Στιγμιότυπο οθόνης του αρχείου καταγραφής συστήματος που δείχνει την ενεργοποίηση του βήματος μετάβασης. Πίστωση εικόνας: Molecular Devices UK Ltd

Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια, με ένα πρωτόκολλο ανάλυσης βλαστοκυττάρων που χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση της συρροής τους κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας (Εικόνα 3Α). Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και αξιολογήθηκαν για δείκτες πολυδυναμικότητας μετά από αρκετές εβδομάδες σε καλλιέργεια και ανακαλλιέργεια.

Η χρώση ανοσοφθορισμού ανέδειξε την έκφραση του SSEA4, ο οποίος είναι ένας επιφανειακός γλυκολιπιδικός δείκτης ενδεικτικός αδιαφοροποίητων πολυδύναμων βλαστοκυττάρων και ο πυρηνικός εντοπισμός του OCT4, ο οποίος είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας απαραίτητος για τη διατήρηση της αυτοανανέωσης και της πολυδυναμίας των βλαστοκυττάρων.

Η παρουσία αυτών των δεικτών επιβεβαιώνει ότι τα κύτταρα ήταν σε θέση να διατηρήσουν το αναπτυξιακό τους δυναμικό και την αδιαφοροποίητη κατάστασή τους. Η χρώση DAPI αποκάλυψε ανέπαφους πυρήνες και υψηλή κυτταρική πυκνότητα σε όλες τις αποικίες.

Η απεικόνιση εκτελείται με το ImageXpress^® Το Σύστημα Διαλογής Υψηλού Περιεχομένου HCS.ai σε μεγέθυνση 10Χ αποκάλυψε καλά καθορισμένες, πυκνά συσκευασμένες αποικίες με ομοιόμορφη, ειδική έκφραση δείκτη (Εικόνα 3Β).

Εικόνα 3. A. Γράφημα συρροής των iPSC κατά την αυτοματοποιημένη καλλιέργεια και διέλευση στο σύστημα CellXpress.ai. Β. Χρώση με ανοσοφθορισμό αποικιών iPSC μετά το τρίτο πέρασμα, που δείχνει έκφραση δεικτών πολυδυναμίας: SSEA4 (πράσινο), δείκτης επιφάνειας και OCT4 (κόκκινο), παράγοντας πυρηνικής μεταγραφής. Οι πυρήνες αντιχρωματίστηκαν με DAPI (μπλε). Οι εικόνες λήφθηκαν και μοντάζονταν κατά τη λήψη σε μεγέθυνση 10Χ χρησιμοποιώντας το σύστημα ImageXpress HCS.ai. Πίστωση εικόνας: Molecular Devices UK Ltd

Έλεγχος ποιότητας βάσει ανάλυσης εικόνας και ανίχνευση διαφοροποιημένων περιοχών

Ένα δεύτερο πρωτόκολλο ανάλυσης εκπαιδεύτηκε για να αναγνωρίζει περιοχές διαφοροποιημένων κυττάρων: ένα ανεπιθύμητο συμβάν κατά την καλλιέργεια iPSC. Το πρωτόκολλο αναπτύχθηκε στο λογισμικό Ανάλυσης Εικόνας IN Carta® χρησιμοποιώντας ένα προεκπαιδευμένο μοντέλο (στο SINAP) που αναγνώριζε συγκεκριμένα κύτταρα και μπαλώματα διαφοροποιημένων κυττάρων και σημάδευε αυτά με μια μάσκα που καλύπτει διαφοροποιημένες περιοχές κυττάρων (Εικόνα 4Α).

Η ανάλυση εικόνας επέτρεψε επίσης την παρακολούθηση της ανάπτυξης και της μορφολογίας του iPSC, ενεργοποιώντας μια καλά καθορισμένη δράση όταν πληρούνται τα κριτήρια που καθορίζονται από τον χρήστη (συρροή διαφοροποιημένων επιθεμάτων κυττάρων). Μια τιμή 0,1 (10 % συρροή) της περιοχής που καλύπτεται με διαφοροποιημένα κύτταρα επιλέχθηκε ως έναυσμα για να αγνοηθεί το αντίστοιχο φρεάτιο (Εικόνα 4Β και Εικόνα 4Γ).

Επιλέχθηκαν επιλογές τόσο για ειδοποίηση του χρήστη όσο και για αυτόματη εξαίρεση των φρεατίων από περαιτέρω καλλιέργεια. Μόλις επιτευχθεί το καθορισμένο από το χρήστη κατώφλι 0,1 (10 % συρροή διαφοροποιημένων περιοχών), τα φρεάτια αποκλείστηκαν από περαιτέρω επεξεργασία, ενώ ειδοποιήσεις αποστέλλονταν επίσης στον χρήστη. Το Σχήμα 4Ε δείχνει πλάκες με πηγάδια που αγνοούνται (γκρίζα).

Το σχέδιο διέλευσης αναπροσαρμόστηκε αυτόματα για να αποφευχθούν τα άδεια φρεάτια κατά τη διέλευση πλακών με διαφοροποιημένα/αγνοημένα φρεάτια. Για παράδειγμα, τα υπόλοιπα φρεάτια διήλθαν σε μειωμένο αριθμό πλακών εάν αγνοηθούν τα φρεάτια Α1 και Β1 των πλακών έξι φρεατίων.

Εικόνα 4. Α. Εικόνες διαφοροποιημένων επιθεμάτων και μάσκες ανάλυσης που καλύπτουν διαφοροποιημένες περιοχές (με μπλε χρώμα). B. Οι κανόνες λήψης αποφάσεων ορίζονται στην ενότητα Ανάλυση. Γ. Ρυθμίσεις κανόνων λήψης αποφάσεων για επισήμανση και αποκλεισμό φρεατίων με παρουσία διαφοροποίησης. Δ. Ακόμη και αρχείο καταγραφής που δείχνει αποφάσεις για εξαίρεση των υποδεικνυόμενων φρεατίων. Κάθε φρεάτιο που εμφανίζει διαφοροποιημένα κελιά με patch που έφτανε το ίσο ή μεγαλύτερο από 0,1 (10 %) συρροής αναγνωρίστηκε από το λογισμικό συστήματος CellXpress. ai. Στάλθηκε ένα μήνυμα ηλεκτρονικού ταχυδρομείου ειδοποίησης χρήστη και τα πηγαδάκια εξαιρέθηκαν (Παράβλεψη) από περαιτέρω κουλτούρα επεξεργασίας (εικόνα, τροφοδοσία και διέλευση). Ε. Οι χάρτες των πλακών δείχνουν τα ενεργά φρεάτια. Τα εξαιρούμενα αντίστοιχα φρεάτια έχουν γκριζάρει. Πίστωση εικόνας: Molecular Devices UK Ltd

Περίληψη

Η καλλιέργεια iPSC είναι μια διαδικασία έντασης εργασίας που απαιτεί ιδιαίτερη προσοχή στη λεπτομέρεια και μια σειρά σχετικής τεχνογνωσίας.

Αυτή η μελέτη παρουσίασε μια πλήρως αυτοματοποιημένη ροή εργασιών καλλιέργειας iPSC που αξιοποιεί ανάλυση βασισμένη σε απεικόνιση και αυτοματοποιημένη λήψη αποφάσεων για τη διέλευση των κυττάρων. Αυτή η προσέγγιση έχει τη δυνατότητα να επιτρέψει τη συντήρηση και την επέκταση των πολιτισμών iPSC χωρίς χέρια, μειώνοντας επομένως τον φόρτο εργασίας με μη αυτόματο τρόπο.

Η λήψη αποφάσεων με βάση την απεικόνιση βοηθά επίσης στον εντοπισμό φρεατίων που παρουσιάζουν σημάδια διαφοροποίησης, διασφαλίζει την καθαρότητα των κυττάρων και διατηρεί τα αντιδραστήρια αποκλείοντας αυτά τα φρεάτια από την επεξεργασία κατάντη.

Αναφορές και περαιτέρω ανάγνωση

1. ATCC (2026).ÂKYOU-DXR0109B Πολυδύναμα Βλαστοκύτταρα (IPS) που προκαλούνται από τον άνθρωπο [201B7]. Διαθέσιμο στη διεύθυνση: https://www.atcc.org/products/acs-1023.
2. Τακαχάσι, Κ., et al(2007). Επαγωγή Πολυδύναμων Βλαστοκυττάρων από Ενήλικα Ανθρώπινα Ινοβλάστες από Καθορισμένους Παράγοντες.ÂΚύτταρο(online) 131(5), σσ.861–872. Διαθέσιμο στη διεύθυνση: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18035408/.

Ευχαριστίες

Παράγεται από υλικά που αρχικά συντάχθηκαν από τους Oksana Sirenko, Krishna Macha και Auguste Kersulyte από την Molecular Devices, LLC.

Σχετικά με τη Molecular Devices UK Ltd

Η Molecular Devices είναι ένας από τους κορυφαίους προμηθευτές στον κόσμο συστημάτων βιοαναλυτικών μετρήσεων, λογισμικού και αναλώσιμων υψηλής απόδοσης για την έρευνα της βιοεπιστήμης, τη φαρμακευτική και βιοθεραπευτική ανάπτυξη. Σε ένα ευρύ χαρτοφυλάκιο προϊόντων περιλαμβάνονται πλατφόρμες για έλεγχο υψηλής απόδοσης, γονιδιωματική και κυτταρική ανάλυση, επιλογή αποικιών και ανίχνευση μικροπλακών. Αυτά τα προϊόντα αιχμής επιτρέπουν στους επιστήμονες να βελτιώσουν την παραγωγικότητα και την αποτελεσματικότητα, επιταχύνοντας τελικά την έρευνα και την ανακάλυψη νέων θεραπευτικών μεθόδων. Η Molecular Devices δεσμεύεται στη συνεχή ανάπτυξη καινοτόμων λύσεων για εφαρμογές της βιοεπιστήμης. Η εταιρεία έχει την έδρα της στο Silicon Valley της Καλιφόρνια, με γραφεία σε όλο τον κόσμο. Για περισσότερες πληροφορίες, επισκεφθείτε τη διεύθυνση www.moleculardevices.com.Â

Πολιτική Χορηγούμενου Περιεχομένου: Το News-Medical.net δημοσιεύει άρθρα και σχετικό περιεχόμενο που μπορεί να προέρχεται από πηγές όπου έχουμε υπάρχουσες εμπορικές σχέσεις, υπό την προϋπόθεση ότι αυτό το περιεχόμενο προσθέτει αξία στο βασικό συντακτικό ήθος του News-Medical.net, το οποίο είναι να εκπαιδεύει και να ενημερώνει τους επισκέπτες του ιστότοπου που ενδιαφέρονται για ιατρική έρευνα, επιστήμη, ιατρικές συσκευές και θεραπείες.