Οι νευρολογικές ασθένειες, συμπεριλαμβανομένης της νόσου του Πάρκινσον και του Αλτσχάιμερ, συνεχίζουν να αποτελούν σημαντική παγκόσμια πρόκληση για την υγεία. Η πρόοδος παρεμποδίστηκε από μια σειρά σημείων συμφόρησης, παρά τις σημαντικές επενδύσεις σε αγωγούς ανακάλυψης και ανάπτυξης φαρμάκων.
Μια βασική πρόκληση που εμποδίζει την πρόοδο ήταν η έλλειψη αξιόπιστων in vitro και ζωντανός μοντέλα που καθοδηγούν με ακρίβεια τον έλεγχο σύνθετων συστατικών και τη βελτιστοποίηση μολύβδου. Οι συμβατικές ροές εργασίας που χρησιμοποιούν κυτταρικές σειρές και ζωικά μοντέλα συχνά αποτυγχάνουν να ανακεφαλαιώσουν την πολυπλοκότητα του ανθρώπινου εγκεφάλου και τις διαταραχές του. Αυτός ο περιορισμός αντιμετωπίστηκε από το πρώτο οργανοειδές μοντέλο εγκεφάλου, που αναπτύχθηκε το 2014 από τους Lancaster et al.1
Τα εγκεφαλικά οργανοειδή προέρχονται από ανθρώπινα επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (iPSCs), με αποτέλεσμα πολύπλοκα τρισδιάστατα μικροσκοπικά μοντέλα τμημάτων του ανθρώπινου εγκεφάλου.
Τα οργανοειδή του εγκεφάλου διαφέρουν από τις παραδοσιακές δισδιάστατες καλλιέργειες στο ότι περιέχουν πολλαπλούς τύπους κυττάρων που αλληλεπιδρούν, επιτρέποντάς τους να ανακεφαλαιώσουν την αρχιτεκτονική και τη δομή του πραγματικού ιστού. Αυτή η πολυπλοκότητα τα καθιστά πολύ πιο κατάλληλα για τη μελέτη της ανάπτυξης του εγκεφάλου και των ασθενειών.
Τα πρωτόκολλα παραγωγής εγκεφάλου οργανοειδών έχουν σημειώσει σημαντικές προόδους τα τελευταία χρόνια, καθιερώνοντας γρήγορα αυτά τα μοντέλα ως βασικά εργαλεία στη μοντελοποίηση ασθενειών, στην ανακάλυψη φαρμάκων και στην εξατομικευμένη ιατρική.2
Η μετάφραση των εγκεφαλικών οργανοειδών σε εργαλεία για την ανάπτυξη φαρμάκων συνεχίζει να αντιμετωπίζει προκλήσεις παρά την πρόοδο αυτή, κυρίως λόγω της κακής αναπαραγωγιμότητας και των πολύπλοκων πρωτοκόλλων έντασης εργασίας που εμποδίζουν την επεκτασιμότητα.
Τα πρωτόκολλα διαφοροποίησης από επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (iPSCs) σε οργανοειδή εγκεφάλου διαφέρουν μεταξύ των συστημάτων μοντέλων, αλλά αυτά τα πρωτόκολλα τυπικά απαιτούν ανταλλαγή μέσων για αρκετούς μήνες, παράλληλα με συνεχή παρακολούθηση.
Αυτή η μακροχρόνια διαδικασία καλλιέργειας παραμένει ένας σημαντικός περιορισμός επειδή οδηγεί σε υψηλή μεταβλητότητα μεταξύ φρεατίων και πλακών.
Το CellXpress.ai® Το Automated Cell Culture System έχει αναπτυχθεί για να ξεπεραστούν αυτές οι προκλήσεις. Το σύστημα συνδυάζει έναν χειριστή υγρού, επωαστήρα και συσκευή απεικόνισης σε μια ενιαία πλατφόρμα, επιτρέποντας τη σπορά, τη τροφοδοσία, τη διέλευση και την παρακολούθηση κυτταροκαλλιεργειών τόσο 2D όσο και 3D (Εικόνες 1 και 2).
Η βελτιστοποίηση των βημάτων χειρισμού υγρών του CellXpress.ai συμβάλλει στη μείωση της μεταβλητότητας μειώνοντας τον κίνδυνο μόλυνσης, ελαχιστοποιώντας παράλληλα τη ζημιά ή την απώλεια οργανοειδών κατά την αναρρόφηση και τη διανομή των μέσων.
Η «Έξυπνη μονάδα πολυμέσων» του συστήματος βελτιώνει σημαντικά τον χρόνο απενεργοποίησης, επιτρέποντας την αποθήκευση αντιδραστηρίων στο κατάστρωμα για αρκετές ημέρες. Αυτές οι μονάδες πολυμέσων θα προθερμάνουν επίσης τα μέσα εκ των προτέρων για να εξασφαλίσουν ότι τα μέσα βρίσκονται στην καθορισμένη θερμοκρασία και διατηρούνται σε αυτήν τη θερμοκρασία μέχρι την ολοκλήρωση της επεξεργασίας της πλάκας.
Τα μέσα ψύχονται αυτόματα μετά το συμβάν τροφοδοσίας, επιτρέποντας την αποθήκευση μέσων στο κατάστρωμα (Εικόνα 1). Οι πλάκες ρεζερβουάρ μπορούν επίσης να αποθηκευτούν στο κατάστρωμα.
Ένας λικνιζόμενος επωαστής μπορεί να ενσωματωθεί στο σύστημα αυτοματοποιημένης κυτταρικής καλλιέργειας CellXpress.ai για να επιτρέψει την καλλιέργεια εγκεφαλικών οργανοειδών και άλλων οργανοειδών που επιπλέουν ελεύθερα παρέχοντας συνεχή ανάδευση των μέσων κατά τη διάρκεια ολόκληρης της διαδικασίας ωρίμανσης.
Αυτή η θερμοκοιτίδα λικνίσματος μπορεί να φιλοξενήσει έως και έξι ράφια με διαμόρφωση ανάμειξης και ταιριάσματος, επιτρέποντας τόσο παλινδρόμηση όσο και στατικές συνθήκες. Αυτή η διαμόρφωση επιτρέπει στα βλαστοκύτταρα να καλλιεργούνται στον ίδιο επωαστήρα με τα οργανοειδή του εγκεφάλου, παρέχοντας μια ροή εργασίας από άκρο σε άκρο για ολόκληρη τη διαδικασία παραγωγής οργανοειδών του εγκεφάλου.
Το σύστημα CellXpress.ai επιτρέπει επίσης τη συνεχή παρακολούθηση της καλλιέργειας μέσω του ενσωματωμένου συστήματος απεικόνισης και αξιοποιεί την ανάλυση εικόνας με τη βοήθεια μηχανικής μάθησης μέσω του IN Carta® Λογισμικό ανάλυσης εικόνας.
Αυτό το άρθρο περιγράφει μια αυτοματοποιημένη ροή εργασιών δημιουργίας εγκεφαλικών οργανοειδών χρησιμοποιώντας το σύστημα CellXpress.ai, από iPSC μέσω διαφοροποίησης και ωρίμανσης σε πολύπλοκα εγκεφαλικά οργανοειδή (Εικόνα 2).
Καθιερώθηκαν μέθοδοι διέλευσης μονοκυττάρων ή θραυσμάτων για την καλλιέργεια βλαστοκυττάρων. Το αρχικό υλικό είναι κρίσιμο για τη διαφοροποίηση των βλαστοκυττάρων σε οργανοειδή του εγκεφάλου και είναι σημαντικό τα βλαστοκύτταρα να εμφανίζουν υγιείς, μη διαφοροποιημένες αποικίες.
Το λογισμικό ανάλυσης εικόνας IN Carta αναπτύχθηκε για τον έλεγχο της ποιότητας των βλαστοκυττάρων. Αυτό το λογισμικό χρησιμοποιεί προηγμένη τεχνητή νοημοσύνη για να επιτρέψει την κατάτμηση των αποικιών και τη διάκριση μεταξύ υγιών και διαφοροποιημένων αποικιών.
Εφαρμόστηκε μια ροή εργασιών για τη δημιουργία εγκεφαλικών οργανοειδών με χρήση ενός rocker και όχι του παραδοσιακά χρησιμοποιούμενου τροχιακού αναδευτήρα. Η ποιότητα των οργανοειδών αξιολογήθηκε μέσω χρώσης ολόκληρης βάσης και λειτουργικών δοκιμασιών.
Αποδείχθηκε επίσης η απρόσκοπτη ενσωμάτωση εξωτερικών συσκευών. Για παράδειγμα, το ImageXpress® Το Confocal HT.ai High Content Imaging System θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για προηγμένη παρακολούθηση, χρησιμοποιώντας την πίσω θύρα του συστήματος CellXpress.ai.
Εικόνα 1. Το ενσωματωμένο υλικό και λογισμικό του συστήματος CellXpress.ai. Πίστωση εικόνας: Molecular Devices UK Ltd
Το CellXpress.ai προσφέρει μια σειρά από οφέλη, όπως:
- Βελτιωμένη συνοχή: Η αυτόματη τροφοδοσία οργανοειδών σημαίνει ότι φροντίζονται με συνέπεια σε καθορισμένο χρονοδιάγραμμα, μειώνοντας το ανθρώπινο λάθος και διασφαλίζοντας πιο αξιόπιστες κατάντη αναλύσεις.
- Μειωμένος κίνδυνος διασταυρούμενης μόλυνσης: Ο αυτοματοποιημένος χειρισμός διατηρεί κάθε βήμα τυποποιημένο και ασφαλές, εξαλείφοντας τον κίνδυνο ανάμειξης μέσων ή κακού χειρισμού των πλακών.
- Μειωμένος κίνδυνος μόλυνσης: Ένα ενσωματωμένο H2Ο2 Το σύστημα απολύμανσης για τον επωαστήρα και η θετική πίεση με φίλτρο HEPA μέσα στο ντουλάπι χειρισμού υγρών βοηθούν στην πρόληψη της μόλυνσης του δείγματος.
- Αποτελεσματική διαχείριση χρόνου: Το σύστημα παρέχει επιταχυνόμενα χρονοδιαγράμματα έρευνας και ανάπτυξης, καθώς οι επιστήμονες επωφελούνται από τον αυξημένο χρόνο παραμονής, που σημαίνει ότι μπορούν να επικεντρωθούν σε πιο κρίσιμες εργασίες.
- Αξιόπιστη και επαναλαμβανόμενη απεικόνιση: Τα αυτοματοποιημένα συστήματα απεικόνισης διαχειρίζονται την απόκτηση εικόνας ρουτίνας και την ανάλυση που βασίζεται σε βαθιά μάθηση, επιτρέποντας αυστηρή παρακολούθηση και έλεγχο ποιότητας.
- Ενσωμάτωση με εξωτερικά όργανα: Η συμβατότητα με εργαλεία λήψης εικόνας και ανάλυσης προάγει τη μοντελοποίηση νευροεκφυλιστικών ασθενειών επιτρέποντας πραγματικά αυτοματισμό καλλιέργειας iPSC από άκρο σε άκρο.
Μέθοδοι
Καλλιέργεια iPSC
Η σειρά πολυδύναμων βλαστοκυττάρων WTC-11 (Gm25256, Coriell Institute for Medical Research) που προκαλείται από τον άνθρωπο (iPSC) χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία εγκεφαλικών οργανοειδών.
Η διέλευση θραυσμάτων πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τα υπάρχοντα πρωτόκολλα, με τη διέλευση και την επέκταση να πραγματοποιούνται χρησιμοποιώντας το Αυτοματοποιημένο Σύστημα Κυτταρικής Καλλιέργειας CellXpress.ai. Τα xiPSCs διαβιβάστηκαν με ένα πέρασμα χρησιμοποιώντας TrypLE και σπάρθηκαν σε πλάκες U-κάτω 96 φρεατίων για να δημιουργηθούν εγκεφαλικά οργανοειδή.
Εγκεφαλικά οργανοειδή
Η παραγωγή εγκεφαλικών οργανοειδών πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ StemCell Technologies (Κατάλογος #08570) όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο. Για την ωρίμανση, οι πλάκες τοποθετήθηκαν είτε σε λικνιστή είτε σε τροχιακό αναδευτήρα για να καταστεί δυνατή η σύγκριση.
Οργανοειδή πρόσθιου εγκεφάλου
Μια πλάκα 96 φρεατίων με πυθμένα U (Greiner, Kremsmünster, DE) χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία οργανοειδών πρόσθιου εγκεφάλου. Την ημέρα 12, τα οργανοειδή είτε μεταφέρθηκαν σε πλάκες εξαιρετικά χαμηλής προσάρτησης έξι φρεατίων (Greiner, Kremsmünster, DE) είτε καλλιεργήθηκαν περαιτέρω σε πλάκες U-πυθμένα 96 φρεατίων.
Για την ωρίμανση, οι πλάκες τοποθετήθηκαν είτε σε λικνιστή είτε σε τροχιακό αναδευτήρα για να καταστεί δυνατή η σύγκριση.
Οργανοειδή του μέσου εγκεφάλου
Η παραγωγή οργανοειδών του μέσου εγκεφάλου διεξήχθη σύμφωνα με το έργο του Renner et al. (2021).3
Ανάλυση εικόνας
Το λογισμικό ανάλυσης εικόνας IN Carta χρησιμοποίησε ένα πρωτόκολλο βασισμένο στη μηχανική μάθηση για να τμηματοποιήσει τις διαφοροποιημένες και μη διαφοροποιημένες αποικίες iPSC. Οι κανόνες λήψης αποφάσεων ορίστηκαν στο πρωτόκολλο με βάση τα αποτελέσματα ανάλυσης εικόνας, επιτρέποντας τόσο την αυτοματοποιημένη διέλευση καλλιέργειας iPSC όσο και τον αποκλεισμό φρεατίων που διαθέτουν διαφοροποίηση.
Χαρακτηρισμός κυττάρων
Οι αποικίες iPSC σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν για δείκτες πολυδυναμίας για να διασφαλιστεί ο ποιοτικός έλεγχος.
Η λειτουργική δραστηριότητα των εγκεφαλικών οργανοειδών μετρήθηκε με αξιολόγηση της ροής ασβεστίου. Αυτό πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το FLIPR® Calcium 6 Assay Kit (Molecular Devices) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.
Η χρώση ολικής βάσης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο που δημοσιεύτηκε από τους Renner et al. για τη διασφάλιση ποιοτικού ελέγχου των οργανοειδών.4
Τα οργανοειδή αρχικά καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας βενζυλική αλκοόλη και βενζοϊκό βενζυλεστέρα. Τα οργανοειδή χρωματίστηκαν μετά από επιτυχή καθαρισμό και πραγματοποιήθηκε απεικόνιση υψηλού περιεχομένου χρησιμοποιώντας το σύστημα ImageXpress HT.ai.
Εικόνα 2. Το σύστημα CellXpress.ai υποστηρίζει την καλλιέργεια τόσο ανθρώπινων iPSC όσο και εγκεφαλικών οργανοειδών. Πίστωση εικόνας: Molecular Devices UK Ltd
Αποτελέσματα
Αυτοματοποιημένη καλλιέργεια βλαστοκυττάρων
Η ποιότητα της πρώτης ύλης είναι το κλειδί για τη δημιουργία εγκεφαλικών οργανοειδών, πράγμα που σημαίνει ότι απαιτούνται βλαστικά κύτταρα υψηλής ποιότητας για την παραγωγή εγκεφαλικών οργανοειδών υψηλής ποιότητας. Ήταν δυνατό να διατηρηθούν οι ανθρώπινες καλλιέργειες iPSC για πολλά περάσματα χρησιμοποιώντας το σύστημα CellXpress.ai.
Η σταθερή ανάπτυξη των αποικιών βλαστοκυττάρων παρατηρήθηκε ως συνεχής αύξηση στον αριθμό των κυττάρων και στη συρροή (Εικόνα 3Α). Καθιερώθηκαν πρωτόκολλα διέλευσης μονοκυττάρων και θραυσμάτων (Εικόνα 3Β) για την καλλιέργεια βλαστοκυττάρων στο σύστημα CellXpress.ai. Η διέλευση θα μπορούσε επίσης να ενεργοποιηθεί αυτόματα όταν η συμβολή φτάσει σε ένα καθορισμένο όριο.
Το σύστημα CellXpress.ai είναι συμβατό με το λογισμικό ανάλυσης εικόνας IN Carta, επιτρέποντας την εφαρμογή βαθιάς μάθησης για τμηματοποίηση αποικιών, προκειμένου να γίνει διάκριση μεταξύ υγιών (Εικόνα 3C) και διαφοροποιημένων κυττάρων (Εικόνα 3D).
Αυτά τα πρωτόκολλα επέτρεψαν τη διαρκή ανάπτυξη ανθρώπινων iPSC, η οποία επαληθεύτηκε σε πολλές πλάκες (Εικόνα 3Ε).
Εικόνα 3. Αυτοματοποιημένη καλλιέργεια βλαστοκυττάρων. (Α) Το λογισμικό χρήστη του συστήματος CellXpress.ai που δείχνει τη ροή εργασιών καλλιέργειας βλαστοκυττάρων. (Β) Διαφορετικό μεθόδους διέλευσης ενσωματωμένες στο σύστημα CellXpress.ai. (Γ, Δ) Βαθιά μάθηση για τμηματοποίηση αποικιών για διάκριση μεταξύ υγιών αποικίες (C) και διαφοροποιημένα κύτταρα (D). (Ε) Η ποσοτικοποίηση της ανάπτυξης της αποικίας παρακολουθήθηκε για 6 ημέρες. Τα τετραγωνίδια δείχνουν τον μέσο όρο του 9 πιάτα. Πίστωση εικόνας: Molecular Devices UK Ltd
Διαφοροποίηση iPSC σε οργανοειδή του εγκεφάλου
Το λογισμικό συστήματος CellXpress.ai προσφέρει διάφορες φάσεις πρωτοκόλλου, όπως τροφοδοσία, σπορά, απεικόνιση και διέλευση. Αυτές οι φάσεις μπορούν να συνδυαστούν όπως απαιτείται για τη δημιουργία ενός πρωτοκόλλου.
Καθιερώθηκε μια ροή εργασιών για την παραγωγή οργανοειδών εγκεφάλου χρησιμοποιώντας τα διάφορα χαρακτηριστικά του συστήματος CellXpress.ai, συμπεριλαμβανομένης της σποράς του iPSC σε πλάκες U-κάτω 96 φρεατίων και κύκλους ρουτίνας τροφοδοσίας και λήψης εικόνας πλακών 96 φρεατίων και έξι φρεατίων (Εικόνα 4Α).
Το σύστημα CellXpress.ai προσφέρει αυξημένο χρόνο πεζοπορίας εκτελώντας με ακρίβεια επαναλαμβανόμενες και επιρρεπείς σε σφάλματα εργασίες κατά την ανάπτυξη οργανοειδών. Η ενσωματωμένη συσκευή απεικόνισης συστήματος CellXpress.ai προσφέρει γρήγορη, πλήρη απόκτηση πλακών 96 φρεατίων και έξι φρεατίων, που σημαίνει ότι κάθε οργανοειδές μπορεί να παρακολουθείται σε υψηλή ανάλυση, επισημαίνοντας σαφώς σημαντικές λεπτομέρειες όπως η εκβλάστηση οργανοειδών (Εικόνα 4Β και Εικόνα 4Γ).
Είναι σημαντικό να διατηρούμε τα εγκεφαλικά οργανοειδή σε κίνηση για να διασφαλίσουμε την επιτυχή ωρίμανση, καθώς είναι εξαιρετικά πεινασμένα και απαιτούν συνεχή παροχή οξυγόνου και θρεπτικών συστατικών. Τα τυπικά πρωτόκολλα περιλαμβάνουν γενικά τη χρήση τροχιακού αναδευτήρα, αλλά η αυτοματοποίησή τους παραμένει πρόκληση.
Αντ’ αυτού, διατίθενται αυτοματοποιημένες λύσεις που χρησιμοποιούν ρολό. Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές για να προσδιοριστεί εάν τα οργανοειδή που αναπτύσσονται σε ένα rocker είναι συγκρίσιμα με αυτά που αναπτύσσονται σε έναν αναδευτήρα (Εικόνα 4D).
Τα εγκεφαλικά οργανοειδή αναπτύχθηκαν επιτυχώς σε ένα ρολό, παρουσιάζοντας χαρακτηριστικά γνωρίσματα όπως η εκβλάστηση της οργανοειδούς επιφάνειας γύρω στην ημέρα 10 (Εικόνα 4Ε). Δεν παρατηρήθηκε διαφορά όταν συγκρίθηκαν οι περιοχές των οργανοειδών που αναπτύχθηκαν σε αναδευτήρα και rocker μετά από 48 ημέρες καλλιέργειας (Εικόνα 4Ε).
Εικόνα 4. Διαφοροποίηση ανθρώπινου iPSC σε οργανοειδή εγκεφάλου. (A) Εικόνα που δείχνει τη ρύθμιση πρωτοκόλλου στο λογισμικό χρήστη του συστήματος CellXpress.ai (Β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες ραμμένης απόκτησης πλήρους φρεατίου της πλάκας 6 φρεατίων. (Γ) Μεγαλωμένο οργανοειδές του Γ. (Δ) Γελοιογραφία της καλλιέργειας των οργανοειδών του εγκεφάλου σε έναν κουνιστή. (Ε) Αντιπροσωπευτικές μεμονωμένες εικόνες οργανοειδών για 36 ημέρες. (ΣΤ) Ποσοτικοποίηση οργανοειδών μεγεθών του οργανοειδή που καλλιεργούνται σε κουνιστή και σέικερ. Ράβδοι κλίμακας B: 10 mm, D: 20 Μ¼ m, C και F: 600 Μ¼ m; Objective 2x air CellXpress.ai ενσωματωμένο μικροσκόπιο (B, C), 4x Evos (F). Πίστωση εικόνας: Molecular Devices UK Ltd
Απόκτηση εικόνας υψηλής ανάλυσης εγκεφαλικών οργανοειδών
Ο συνδυασμός των δυνατοτήτων αυτοματισμού του συστήματος CellXpress.ai και της ικανότητας απεικόνισης του συστήματος ImageXpress HT.ai επέτρεψε τη λήψη εικόνων υψηλής ανάλυσης εγκεφαλικών οργανοειδών.
Το σύστημα ImageXpress HT.ai προσφέρει υψηλή ανάλυση και ποιότητα εικόνας σε μια σειρά επιπέδων μεγέθυνσης, επιτρέποντας ταυτόχρονα μια λεπτομερή προβολή των περιοχών και μια ολιστική προβολή του οργανοειδούς. Τα φλοιώδη στρώματα είναι επίσης καθαρά ορατά (Εικόνα 5Α έως Σχήμα 5Δ).
Οι πολλαπλοί τρόποι απεικόνισης τεκμηριώνουν συλλογικά τη λειτουργικότητα και τη βιωσιμότητα των νευρώνων στα εγκεφαλικά οργανοειδή που απεικονίζονται.
Εικόνα 5. Απόκτηση εικόνας υψηλής ανάλυσης. Παραδειγματικές εικόνες εγκεφαλικών οργανοειδών. (Α) Ραμμένη μέγιστη προβολή εικόνας υψηλής ανάλυσης, 6×6 πλακάκια, 200 z-planes – 2 m¼m απόσταση μεταξύ των επιπέδων. (B) Μεγέθυνση στην περιοχή που υποδεικνύεται στο A. (C) Χωρική έγχρωμη προβολή της περιοχής υποδεικνύεται στο Α για να δείχνει φλοιώδεις στιβάδες. (D) Μεγέθυνση στην περιοχή που υποδεικνύεται στο B. Γραμμή κλίμακας: A: 1mm, B—D: 20 μ¼m, AD: Στόχος 20x νερό βύθιση στο σύστημα ImageXpress HT.ai. Πίστωση εικόνας: Molecular Devices UK Ltd
Ανάλυση εγκεφαλικών οργανοειδών
Η λειτουργική δραστηριότητα των εγκεφαλικών οργανοειδών προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας Calcium 6 Assay. Οι αλλαγές στην ενδοκυτταρική συγκέντρωση ασβεστίου παρακολουθήθηκαν με την πάροδο του χρόνου, αντανακλώντας τη νευρωνική δραστηριότητα. Η λειτουργία απόκτησης ροής του συστήματος ImageXpress HT.ai χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της νευρωνικής δραστηριότητας, αποκαλύπτοντας τη δημιουργία λειτουργικά ενεργών εγκεφαλικών οργανοειδών (Εικόνα 6Α έως Σχήμα 6ΣΤ).
Εικόνα 6. Απόκτηση και ανάλυση εικόνας. (Α) Απόκτηση ροής ενός οργανοειδούς εγκεφάλου βαμμένου με ασβέστιο. (Β) Κυμογράφημα του Α που δείχνει δραστηριότητα ασβεστίου. (Γ) Μέγιστη προβολή υψηλής ανάλυσης στοίβας Z του οργανοειδούς Α. (Δ) Απόκτηση ρεύματος υψηλής ανάλυσης νευρωνικού δικτύου του οργανοειδούς στο C. (Ε) Κυμογράφημα νευρωνικού δικτύου του D. (F) Μεμονωμένα νευρωνικά ίχνη του D, οι νευρώνες υποδεικνύονται με πορτοκαλί πλαίσια. Α, Β: 4x δημιουργία αντικειμένων στο αυτοματοποιημένο μικροσκόπιο του συστήματος CellXpress.ai, ρυθμός καρέ 70 ms. C–E: Το σύστημα ImageXpress HT.ai 20x νερό βύθιση. DF: Μέγεθος βήματος 2 Μ¼ m, ρυθμός καρέ 20 ms. Ράβδος κλίμακας A, C = 1 mm, D = 10 Μ¼ m. Πίστωση εικόνας: Molecular Devices UK Ltd
Δημιουργία οργανοειδών μεσαίου εγκεφάλου στο σύστημα CellXpress.ai
Το σύστημα CellXpress.ai χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία μιας αυτοματοποιημένης ροής εργασιών δημιουργίας οργανοειδών μεσεγκεφάλου (Εικόνα 7Α). Η ανάπτυξη των οργανοειδών του μεσεγκεφάλου παρακολουθήθηκε με την πάροδο του χρόνου χρησιμοποιώντας την ενσωματωμένη λειτουργία κυτταρικού ταξιδιού του συστήματος (Εικόνα 7Β).
Για τον ποιοτικό έλεγχο των οργανοειδών του μεσαίου εγκεφάλου πραγματοποιήθηκαν χρώση σε ολόκληρο το σώμα και απεικόνιση ασβεστίου. Η χρώση ολόκληρων οργανοειδών του μεσαίου εγκεφάλου απαιτούσε οπτικό καθαρισμό για βελτιωμένη διείσδυση φωτός (Εικόνα 7C). Αφού καθαρίστηκαν, τα οργανοειδή χρωματίστηκαν με αντισώματα φθορισμού πριν από την απεικόνιση χρησιμοποιώντας το σύστημα ImageXpress HT.ai υψηλής περιεκτικότητας.
Η χρήση χρώσης ανοσοφθορισμού σε ολόκληρο το σώμα παρέχει εικόνες υψηλής ποιότητας οργανοειδών του μεσεγκεφάλου, που δείχνουν καθαρά φαινοτυπικά και μορφολογικά χαρακτηριστικά (Εικόνα 7D).
Παρακολουθήθηκαν επίσης οργανοειδή του μεσαίου εγκεφάλου βαμμένα με ασβέστιο, με μεμονωμένους νευρώνες να εντοπίζονται για νευρωνική δραστηριότητα αφού επιλέχθηκαν από τέσσερις διαφορετικές περιοχές του οργανοειδούς. Αυτή η προσέγγιση δείχνει λειτουργικότητα σε όλο το οργανοειδές του μεσεγκεφάλου (Εικόνα 7Ε).
Εικόνα 7. Δημιουργία μεσαίου εγκεφάλου στο σύστημα CellXpress.ai. (Α) Λογισμικό χρήστη που εμφανίζει οργανοειδή του μεσεγκεφάλου που καλλιεργούνται στο CellXpress.ai σύστημα. (Β) Κυτταρικό ταξίδι για παρακολούθηση μεμονωμένων οργανοειδών με την πάροδο του χρόνου. (Γ) Εικόνες πριν και μετά την εκκαθάριση. (Δ) Μέγιστη προβολή του α λεκέ ολόκληρου ενός καθαρού οργανοειδούς μεσεγκεφάλου. (Ε) Απόκτηση ροής ενός ενδιάμεσου εγκεφάλου βαμμένου με ασβέστιο, συμπεριλαμβανομένου ενός μεμονωμένου νευρώνα ίχνη για τέσσερις περιοχές (1–4). A, B: Το ενσωματωμένο μικροσκόπιο του συστήματος CellXpress.ai, 4x αντικειμενικός αέρας. C: Evos XL 10x air object, D, E: Ο αντικειμενικός στόχος εμβάπτισης του συστήματος ImageXpress HT.ai 20x. Πίστωση εικόνας: Molecular Devices UK Ltd
Φαινοτυπική ταξινόμηση εγκεφαλικών οργανοειδών
Η κατανόηση του οργανοειδούς φαινοτύπου είναι το κλειδί για τη διαφοροποίηση μεταξύ «καλών» και «κακών» οργανοειδών. Ο αποκλεισμός των οργανοειδών που εμφανίζουν ανεπιθύμητους φαινοτύπους από περαιτέρω στάδια επεξεργασίας, όπως η τροφοδοσία και η απεικόνιση, θα περιορίσει κατά συνέπεια τον αντίκτυπο των σπατάλης μέσων και χρόνου.
Το εργαλείο φαινογλυφικών του λογισμικού IN Carta επιτρέπει τη φαινοτυπική ταξινόμηση των εγκεφαλικών οργανοειδών (Εικόνα 8Α). Είναι δυνατή η χειροκίνητη εκτέλεση ταξινόμησης, αλλά ο αλγόριθμος βαθιάς εκμάθησης του λογισμικού IN Carta μπορεί να εφαρμοστεί για να επιταχύνει τη διαδικασία.
Η μήτρα σύγχυσης που φαίνεται στο Σχήμα 8Β υπογραμμίζει μια συνεπή αντιστοίχιση μεταξύ φαινοτυπικών ετικετών που σχολιάζονται αυτόματα και προσδιορίζονται με μη αυτόματο τρόπο, υπογραμμίζοντας τη χρησιμότητα του λογισμικού IN Carta στην αυτοματοποίηση των ροών εργασιών επέκτασης των οργανοειδών του εγκεφάλου.
Εικόνα 8. (Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες τάξεων που χρησιμοποιούνται για την ταξινόμηση οργανοειδών. (Β) Πίνακας σύγχυσης μεταξύ του συνόλου δεδομένων με αυτόματα σχολιασμό και του βασικού δεδομένων αλήθειας. Στόχος 4x αέρας? Ράβδοι ζυγαριάς: 200 μ.μ. Πίστωση εικόνας: Molecular Devices UK Ltd
Σύναψη
Η αναπτυγμένη ροή εργασίας απέδειξε ότι τα οργανοειδή του εγκεφάλου που παράγονται χρησιμοποιώντας το Αυτοματοποιημένο Σύστημα Κυτταρικής Καλλιέργειας CellXpress.ai είναι συγκρίσιμα με τα εγκεφαλικά οργανοειδή που παράγονται με το χέρι, όσον αφορά το μέγεθος και τη νευρωνική δραστηριότητα.
Το σύστημα αποδείχθηκε ότι υποστηρίζει με επιτυχία την ταυτόχρονη καλλιέργεια γραμμών iPSC, ελεύθερα επιπλεόντων οργανοειδών εγκεφάλου σε πλάκες έξι φρεατίων, καθώς και μεμονωμένων οργανοειδών σε πλάκες 96 φρεατίων.
Το ενσωματωμένο σύστημα απεικόνισης επέτρεψε την αυτοματοποιημένη λήψη εικόνας σε διάφορα συστήματα μοντέλων και φορμά πλακών, ακολουθούμενη από αξιόπιστη τμηματοποίηση και ταξινόμηση εικόνων χωρίς ετικέτες προσαρμοσμένη σε κάθε μοντέλο.
Αυτή η ολοκληρωμένη, πλήρως ενσωματωμένη λύση υπογραμμίζει τη σκοπιμότητα μιας ισχυρής, επεκτάσιμης και υψηλής απόδοσης παραγωγής οργανοειδών εγκεφάλου σε μια ενιαία αυτοματοποιημένη πλατφόρμα, από υγιή βλαστοκύτταρα έως ώριμα, λειτουργικά εγκεφαλικά οργανοειδή.
Αναφορές και περαιτέρω ανάγνωση
- Lancaster, MA, και Knoblich, JA (2014). Δημιουργία εγκεφαλικών οργανοειδών από ανθρώπινα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα.ÂΠρωτόκολλα της φύσης,ΕΝΑ9(10), 2329–2340. DOI: 10.1038/nprot.2014.158. https://www.nature.com/articles/nprot.2014.158.
- Birtele, M., Lancaster, M. and Giorgia Quadrato (2024). Μοντελοποίηση ανάπτυξης του ανθρώπινου εγκεφάλου και ασθένειας με οργανοειδή.ÂNature Reviews Molecular Cell Biology. (σε απευθείας σύνδεση) DOI: 10.1038/s41580-024-00804-1. https://www.nature.com/articles/s41580-024-00804-1.
- Renner, H., et al(2021). Δημιουργία και Συντήρηση Ομογενών Ανθρώπινων Οργανοειδών Μεσεγκεφάλου.ÂΒΙΟ-ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ11(11). DOI: 10.21769/bioprotoc.4049. https://bio-protocol.org/en/bpdetail?id=4049&type=0.
- Renner, H., et al. (2021). Ανάλυση ενός κυττάρου βασισμένη σε φθορισμό χρωματισμένων και καθαρισμένων μικροϊστών και οργανοειδών για ολόκληρη τη βάση για διαλογή υψηλής απόδοσης. ΒΙΟ-ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ11(12). DOI: 10.21769/bioprotoc.4050. https://bio-protocol.org/en/bpdetail?id=4050&type=0.
Ευχαριστίες
Παράγεται από υλικά που αρχικά συντάχθηκαν από τους Felix Spira, PhD, και Sandra Grund-Gröschke, PhD, από την Molecular Devices, LLC.
Σχετικά με τη Molecular Devices UK Ltd
Η Molecular Devices είναι ένας από τους κορυφαίους προμηθευτές στον κόσμο συστημάτων βιοαναλυτικών μετρήσεων, λογισμικού και αναλώσιμων υψηλής απόδοσης για την έρευνα της βιοεπιστήμης, τη φαρμακευτική και βιοθεραπευτική ανάπτυξη. Σε ένα ευρύ χαρτοφυλάκιο προϊόντων περιλαμβάνονται πλατφόρμες για έλεγχο υψηλής απόδοσης, γονιδιωματική και κυτταρική ανάλυση, επιλογή αποικιών και ανίχνευση μικροπλακών. Αυτά τα προϊόντα αιχμής επιτρέπουν στους επιστήμονες να βελτιώσουν την παραγωγικότητα και την αποτελεσματικότητα, επιταχύνοντας τελικά την έρευνα και την ανακάλυψη νέων θεραπευτικών μεθόδων. Η Molecular Devices δεσμεύεται στη συνεχή ανάπτυξη καινοτόμων λύσεων για εφαρμογές της βιοεπιστήμης. Η εταιρεία έχει την έδρα της στο Silicon Valley της Καλιφόρνια, με γραφεία σε όλο τον κόσμο. Για περισσότερες πληροφορίες, επισκεφθείτε τη διεύθυνση www.moleculardevices.com.Â
Πολιτική Χορηγούμενου Περιεχομένου: Το News-Medical.net δημοσιεύει άρθρα και σχετικό περιεχόμενο που μπορεί να προέρχεται από πηγές όπου έχουμε υπάρχουσες εμπορικές σχέσεις, υπό την προϋπόθεση ότι αυτό το περιεχόμενο προσθέτει αξία στο βασικό συντακτικό ήθος του News-Medical.Net, το οποίο είναι να εκπαιδεύει και να ενημερώνει τους επισκέπτες του ιστότοπου που ενδιαφέρονται για ιατρική έρευνα, επιστήμη, ιατρικές συσκευές και θεραπείες.
/2026/05/29/6a199ba542f3a918055986.jpg "Roland-Garros 2026: “Ξέρει πού θέλει να πάει”… Διαγωνιζόμενος στον τρίτο γύρο και αρχάριος σε αυτό το επίπεδο, ο Moïse Kouame είναι ήδη έτοιμος να ονειρευτεί μεγαλύτερα;")